多細胞同時記録実験の必要性と方法−現状と問題点− 　　　　　　　　　　　　櫻井芳雄　　京都大学霊長類研究所 　　　　　　　　　　　　　　　　　　岡崎国立共同研究機構生理学研究所 　　　　　　　　　　　　　　　　　　科学技術振興事業団さきがけ研究21 １. はじめに 　脳はその多様で独特な高次機能をどのように実現しているのであろうか？ 一体そこではどのような情報処理方式が採られているのだろうか？　この誰で も思いつきそうな問いは，実際に脳を研究する立場からは意外と意識されてい ない。現在隆盛の一途をたどる脳の実験的研究は，ある機能にどの伝達物質が 関わっているのか（what），あるいは，ある機能にどの部位が関わっているの か（where），に関するものが圧倒的に多い。ある機能がどのように処理され 実現されているのか（how）に焦点を当てた実験的研究は，極めて少ない。何 よりも，脳内では何が情報処理の基本コードであるのか，つまり情報表現（符 号化）の基本的単位さえもまだ明らかではない。それをまず明らかにし，そこ から情報処理方式について解明していくことこそ，ミクロな伝達物質からマク ロな機能地図にまたがる，様々なレベルの研究成果を統合していく鍵である。 またそれは，脳に関する膨大な実験的データと，急速に進展しつつある脳の理 論的研究との協調と統合への道でもある。　 ２. ニューロン活動記録実験の目的 　脳機能の中でも特に高次な情報処理の研究となると，脳のどこが関与している かという，マクロな機能地図の解明がまず先行する。事実，サルの破壊実験や ヒトの脳損傷例から，様々な情報処理に関与する特定の脳部位の存在が，次第 に明らかになってきた。脳損傷を作る破壊実験は，脳と行動とを対応させる研 究の古典的かつ基本的方法であり，最近開発が進んでいる脳活動の非侵襲的計 測法の結果と対応させることで，マクロな機能地図に関する多くの知見を，今 後も提供してくれるはずである。しかし言うまでもなく，そのような機能地図 は，脳のすばらしい情報処理の仕組みについては何も教えてくれない。そこ で，特定の脳部位内での情報処理の動態について直接測定し解析する方法とな ると，微小電極による単一ニューロン活動の記録となる。この技術はすでに 1950年代に開発されており，これまでの膨大な研究成果から，各ニューロンは それぞれ個性的であり，その個性も脳の部位毎に異なることがわかっている。 ところが，そのような研究で主に用いられるロジックは，「○（部位）には△ （働き）を持つニューロンが多く存在した。よって○は△に関与する」という ものである。もちろんこのような知見も十分に意義がある。しかし，せっかく 脳というシステムを構成するニューロンの動態をリアルタイムで計測していな がら，破壊実験と同様にマクロな機能地図の作成だけをめざすとしたら何とも もったいないし，そのほうなロジックでは，脳の情報処理の仕組みは何も解明 されない。また当然のことながら，脳部位の機能はそこでの超複雑な回路網の 働きにより実現されている。にも関わらず，ある特性を持つニューロンが多い か少ないかで，その部位の主な機能が決まるとしたら，脳はニューロンという 有権者による単なる多数決で，各部位の機能を決めていることになる。ニュー ロン回路網の中での個性の相互作用や協調自体には，果たして意味がないので あろうか？　ニューロン活動の記録実験にとって今後必要なことは，超複雑な 回路網の構成単位を対象としていることを意識しながら，その動態を解析する ことであり，さらにそこから，脳の情報処理様式の解明へと進むことである。 ３. 単一ニューロンから動的神経回路へ 　ニューロン活動の解析から脳の情報処理様式の解明へと進む際，まずはじめ に明らかにしておかねばならない大問題がある。単一ニューロンの活動と複数 ニューロン集団の活動のどちらが，情報の基本コードかである。全ての情報や 事象はそれぞれに対応した特定のニューロンにより脳内で表現されるというの が，単一ニューロン主義(single neuron doctorine)である。外界刺激の認識 に関しては，認識細胞説やお婆さん細胞説などとも言われる。もちろんこの場 合の単一とは，ある情報を表現するニューロンが脳内に１つだけあるという意 味ではない。その様なニューロンは多数存在するが，情報を表現する単位は 個々のニューロンという意味である。 　例えば，動物に様々な刺激を見せながらニューロン活動を記録したとする。そ の時，刺激Ａに対してより発火を増大させたニューロンがあったとしたら，そ れは脳内でＡを表現するとニューロンと解釈される。普通このような実験で は，同じ刺激を数回から数十回繰り返し提示し，その都度の活動を全て足しあ わせた加算平均ヒストグラムによりニューロン活動を表す。しかしその動物や 我々がＡを認識するには，よほど注意散漫でない限り，繰り返し加算は必要な いのである。つまり，このような不安定なニューロンが単独でＡを表現しきれ るとは，とても考えられない。ほとんどのニューロンは常に不規則な自発発火 を繰り返しており，発火間隔の変動を表すその標準偏差は，平均値とほぼ同じ で極めて大きい。たしかに切片標本を用いた最近の研究は，ニューロン自体に は正確なタイミングで発火する能力があることを示している。しかし膨大な数 のニューロンが回路網を作る実際の脳では，１つのニューロンが他のニュー ロンからのシナプスを数千から１万も持っている。となると，個々のシナプス 入力がまれで，それによる個々の膜電位変化が小さくとも，これだけ膨大な数 のシナプスから入力を受け取っていると，細胞全体の膜電位には常に脳波のよ うなランダムな変化が生じてしまう。そしてそれが不規則に閾値を超えること で，ランダムな自発発火を繰り返す。それでも，特定の事象に対した時のみ極 めて高頻度に発火すれば，ＳＮ比（信号雑音比）は良くなり得る。しかし，そ のような発火を受けとる次のニューロンのシナプス後膜の応答性は鈍く，15ヘ ルツ以上の発火はそこでゆがんでしまい，あまり意味をなさないという。結 局，単一のニューロンはどれもＳＮ比の悪い不安定なしろものであり，情報を 十分に表現する単位にはなり得ない。 　さらに単一ニューロン主義については，次の問題点もよく指摘される。1) 単 一ニューロンの発火は，次のニューロンの細胞膜に極めて小さい変化しか起こ し得ず，単独ではほとんど無力である。2) 実験場面で恣意的に選んだ事象の 中でさえ，一つのニューロンがそれらのうちの複数に応答することも多い。3) ある特定の機能に関わる脳領域が壊れた際，他の部位がその機能を代行する ことがある（ニューロンの機能変化による代償）。また実験事実に基づかなく とも，以下の問題点は容易に思いつく。1) 事象の組合せは新たな事象を生み （お婆さん→帽子をかぶったお婆さん→帽子をかぶって自転車に乗っているお 婆さん），それは無数に作れるが，有限な個々のニューロンでこのほぼ無限な 事象に対応できるか（組み合わせ爆発の問題）。2) 情報間の連合，分離，類 似度，構造化等を，個々のニューロンで十分に表現できるか。3) 多数の ニューロンが毎日死滅しているにも関わらず，脳内の情報が次々死滅していか ないのはなぜか。 　これらのことから，何らかのニューロン集団が協調的に働くことにより情報を 表現するという，集団的・協調的符号化（population ensemble coding）をど うしても考えざるを得ない。ただしここでの集団という言葉は，個々のニュー ロンが無個性で均質であり集団となって始めて意味を持つ，ということではな い。ニューロンが個性的であることはすでにわかっている。それら個性の協調 が情報を表現するということである。つまり，単一ニューロンの個性を生かし ながら，少数の局所集団から膨大な大集団までのどこをも含み得る，連続性の ある動的な回路を，脳内情報を表現する基本的単位と考えるべきであろう。 ４. 動的神経回路としてのセル・アセンブリ 　情報を担い得る連続性のある動的な回路は何かとなると，かつて心理学者 D. O.Hebb が唱えたセルアセンブリ（cell assembly 細胞集成体）をまず思いつ く。セルアセンブリとは，協調的ニューロン集団により随時形成される機能的 回路である。個々のニューロンが機能の異なる複数の回路に重複して結合し， なおかつ必要な情報処理に応じて回路内や回路間の結合を変化させ，大小の閉 回路を随時形成する。複数の情報処理の同時進行が可能なわけで，まさしく脳 独特の並列分散処理の実現である。同じ性質のニューロンが単に集まるだけの 量作用説（mass action）とは異なり，回路内の個々のニューロンもある程度 の個性を持っている。回路を構成するニューロンを結合するシナプス強度の増 減は，Hebb則，つまりシナプス前ニューロンと後ニューロンの活動相関により 制御される。セルアセンブリの主な特徴は２つあり，一つは異なる回路間での ニューロンの重複（neurons overlapping），もう一つは機能的シナプス結合 の変化による回路自体の動的な変化（connection dynamics）である。これが それを実験的に検出する際のカギになる（櫻井,1998a; Sakurai,1996a;1998 ab,1999）。　 ５. 多細胞同時記録実験の方法 　セル・アセンブリという動的で機能的な回路を直接測定するための新技術は， 光学的測定法などを中心として次第に開発されつつあるが，決して容易ではな い。そこで，従来のニューロン活動記録する技術を応用し改善することによ り，回路の部分的な活動を検出し，その背景にある回路網全体の働きを明らか にしようとする方法が，多細胞同時記録であり，マルチニューロン活動の同時 記録，マルチユニットの記録（multiunit recording），多点同時記録 （multichannel neuronal recording）などとも呼ばれる。　 　個々のニューロン活動を，多数しかも同時に測定するためには，三つの基本 的技術が必要である。すなわち，記録電極の作製と選定，電極の配列と操作， データの取り込み，である。以下，その順に簡単に解説する。なお，ニュー ロン活動の記録に関する基本的な解説として櫻井(1998bc)が，また，多細胞同 時記録から解析に至る最近の優れた解説として伊藤(1998)がある。さらに，こ の技術による研究の隆盛を示すものとして，より詳しい単行本も最近は相次い で出版されている（Eichenbuam & Davis, 1998; Nicolelis, 1998）。 ５−１. 記録電極の作製と選定 　従来の微小電極を単に並べるだけでは，電極間の距離がどうしてもある一定 以上離れてしまい，回路を構成しているはずの近傍の多数ニューロンから同時 記録することは難しい。そこで，個々の電極の先端を工夫することで，狭い範 囲に存在するほぼ全てのニューロンの活動を同時に検出する特殊電極が，いく つか考えられてる。いずれも一本の電極に多数の記録点を設けたものであり， 多点電極などと呼ばれる。例えば，マルチファイバー電極はThomas社から市販 されており，シリコンプローブ電極はミシガン大学のCenter for Neural Communication Technologyから供給されている。またそのような電極自体に， 増幅回路やマルチプレクサ回路等を焼き付けたものもあり，例えば32点の記録 点からの信号を増幅し同時測定することが可能な電極もある。ステレオトロー ドやテトロードと呼ばれる電極は自作されることが多い。　 ５−２. 電極の配列と操作 　より多数の電極を刺入したい場合は，市販のワイヤー電極（Californica Fine Wire社やAM-Systems社など）を多数配列して慢性的に埋め込む方法が適 している。例えば何十本ものニクロムワイヤーをポリエチレングリコール（# 4000）で一時的に固め，脳内に埋め込むことが可能である。ポリエチレングリ コールは体温で溶けて代謝吸収されるため，ワイヤー電極のみが脳内に残り， その柔らかさのために脳の動きと連動することから，極めて安定した長期間記 録が可能となる（Floating電極）。しかし，電極の本数を少なくしてでもそれ を脳内で動かせる可動電極が，ニューロン活動の検出にはより効率的な場合も 多い。ラットの場合は，マイクロドライブと呼ばれる装置を頭蓋骨上に固定 し，その可動部分に電極を複数配列し，可動部分を操作することで電極列を随 時脳内へ刺入していく（Sakurai, 1993; 1994; 1996b）。ラットは自由行動の 状態で実験することが多いため，マイクロドライブはまず軽量であることが必 要であり，接続用ソケットも頭蓋上にしっかり固定し，ラットの後肢による ひっかきから守るためのガードも装着しなければならない。この方法をさらに 拡張して電極の本数を増やし，個々の電極も個別に操作できるようにしたもの が，最近市販されているハイパードライブ（Kopf社）である。これらマイクロ ドライブやハイパードライブをより小型化すれば，マウスへの使用も可能であ る。 　サルを用いる場合は，頭部を固定する場合がほとんどであるため，複数電極 の操作が可能なマニピュレータと操作システムを記録時に頭部に装着し，課題 遂行中に電極を個別に動かすことが可能である。また，課題遂行中に電極を動 かす必要がなく，比較的長時間の記録を必要とする場合は，上記のラット用マ イクロドライブを改作してサルに使うことも可能である。これらのマニピュ レータ方式とマイクロドライブ方式には，それぞれにいくつもの長所と短所が あるため，実験目的に合わせ使い分ける必要がある。 　 ５−３. データの取り込み 　検出したマルチニューロン活動をデータとして取り込む場合，まず個々の ニューロンの活動に分離しなければならない（スパイク・アイソレー ション）。マルチニューロン活動の記録のほとんどは細胞外記録であるが，そ の場合，同じニューロンからのスパイクでも，電極とニューロンとの距離によ り，その波形はかなり変動こともある。特に海馬にある錐体細胞のように，ス パイクがバースト状に短時間に続けて出るときには，波形の変形も大きなる。 このようなことから，スパイクの全体的な波形に基づき個々のニューロン活動 に分離する方法，すなわち，テンプレート・マッチング（template matching）やウエーブフォーム・マッチング（waveform matching）と呼ばれ る方法は，適切でない場合もある。そこでスパイクを，その波形がもつ様々な パラメータ毎に分類し（スパイクの高さ，時間幅，電位変化の時間，他），そ れらパラメータの変動を相対的に比較することで，個々のニューロン活動に分 離するという方法が採られることも多い。これをクラスター・カッティング （cluster cutting）と呼ぶ。この方法を用いれば，たとえスパイク波形のあ るパラメータが変動しても，それが連続的に一定の範囲（cluster）内に収 まっており，さらに他のパラメータと一定の関係を保っていれば，同じニュー ロンからのスパイクであると判定することができる。この方法は，異なる電極 で記録されたスパイク間に見られるパラメータの変動をも比較することで，ア イソレーションの精度をより上げることができるため，先に紹介した様々な多 点電極と共に用いられることが多い。特にステレオトロード電極やテトロード 電極と共に用いると，より有効である。ただし，テトロード電極はステレオト ロード電極の倍数の電極を用いるが，検出できるニューロン数も倍となるわけ ではない。またこれらの電極を用いる際のクラスター・カッティングは，かな りの時間を要するため，オンラインでデータ収集と解析を済ませようとする実 験には適さないことも多い。 　テンプレート・マッチングやウエーブフォーム・マッチングは，専用のソ フトも市販されているが（Signal Processing社など），そのためのシステム をある程度自作することも可能である。クラスター・カッティングのような複 雑な処理となると，専用のソフトを搭載した市販のシステム（Data Wave社な ど）を用いることも多い。しかしその場合，どうしても個々の実験にとって不 都合が箇所が出てくるため，最近は独自のソフトとシステムを作成するラボも 増えている。 ５−４. データ解析の前提 　以上の技術を駆使して集めたマルチニューロンのスパイク列を，従来の ニューロン活動の記録実験のように，そのままヒストグラムやラスター・プ ロットで表示しただけでは，それが回路網のどのような働きを表しているの か，当然のことながら全くわからない。そのようなスパイク列から一定の意味 を抽出する方法こそが，データ解析法である。しかし，マルチニューロンの活 動をまとめて解析し，回路網の働きを一気に表示し得る一般的な解析法はな い。推計学的あるいは統計学的な観点から見て，３つ以上の変数（ニューロン 活動）間の相互関係と個々の変数の変動をまとめて可視化する方法など，まず 不可能である。そこで，まず回路網の働きに関する何らかの仮説を構築し，そ の仮説から当然導き出されるであろう局所的な現象を順次検証していくという ことが必要になる。つまり何らかの仮説演繹法こそ，マルチニューロン活動の 解析の大前提であろう。　 ６. 技術以前に考えるべきこと 　より多数のニューロン活動を記録するためのハードウエアの技術は，現在進 行形で急速に進んでいる。特に最近は，生理学的研究者と電子工学研究者の共 同研究により，電極からの接続ケーブルさせ使わない完全無拘束の動物から， 多数のニューロン活動を同時記録するシステムなども開発されており（山本 他, 1999），多細胞活動の同時記録実験は，今後ますます増大し進展するはず である。つまり，電極の選定→電極の配列と操作→データの取り込み，につい ては，技術的な困難さはまだあるものの，それを克服しつつ進展し，膨大な データが蓄積されていくことは間違いない。しかし多細胞同時記録実験が，そ の目的，つまり神経回路網の動態の解明に到達するか否かは，その後にくる データ解析にかかっている。そのためには，先に述べたように，回路網の働き に関する有効な仮説の構築からまず出発しなければならない。結局，この方法 による研究の真価を決めるものは，実験のハードウエアに関する技術というよ りも，それを活かすための，脳の情報処理に関する理論的枠組みとモデルの構 築なのである。 参考文献（本文中に示したもの） * Eichenbaum, H. and Davis, J. L. (Eds.) : Neuronal ensembles: strategies for recording and decoding. Welly-Liss, New York, 1998. * 伊藤浩之 : 多細胞活動同時測定法. 医学のあゆみ, 184:599-605, 1998. * Nicolelis, M. A. L. (Ed.) : Methods for neural ensemble recordings. CRC Press, New York, 1998. * 櫻井芳雄 : ニューロンから心をさぐる. 岩波書店, 東京, 1998a. * 櫻井芳雄 : 脳神経科学の研究法―電気的活動記録法. 新生理心理学（宮田 洋監修）, pp.62-65, 北大路書房, 京都, 1998b. * 櫻井芳雄 : 多数ニューロン活動の同時記録法. 脳の科学, 20:1233-1237, 1998c. * Sakurai, Y. : Dependence of functional synaptic connections of hippocampal and neocortical neurons on types of memory. Neurosci. Lett., 158:181-184, 1993. * Sakurai, Y. : Involvement of auditory cortical and hippocampal neurons in auditory working memory and reference memory in the rat. J. Neurosci., 14:2606-2623, 1994. * Sakurai, Y. : Population coding by cell assemblies - what it really is in the brain. Neurosci. Res. 26:1-16, 1996a. * Sakurai, Y. : Hippocampal and neocortical cell assemblies encode memory processes for different types of stimuli in the rat. J. Neurosci., 16:2809-2819, 1996b. * Sakurai, Y. : The search for cell assemblies in the working brain. Behav. Brain Res., 91 :1-13, 1998a. * Sakurai, Y. : Cell-assembly coding in several memory processes. Neurobiol. Learning & Memory, 70:212-225, 1998b. * Sakurai, Y. : How do cell assemblies encode information in the brain ? Neurosci. Biobehav. Rev., 1999 (In press). * 山本純, 高橋宗良, 塚田稔, 安西祐一郎 :　Analog FPAAと組込用MCUを用い た完全無拘束動物実験のための多点ニューロン同時計測システムの開発. 日本 神経回路学会誌, 6: 3-10, 1999.